贵州大学发现首个抗植物病毒相分离抑制剂

　　12月23日，贵州大学绿色农药全国重点实验室博士生王艳菊在Aggregate(影响因子IF=13.9)期刊发表了题为“A Vanillin‐Derived Inhibitor of Aggregates via Targeting Intrinsically Disordered Regions of Phytoviral Nucleocapsid Protein”的研究论文，揭示了香草醛衍生物29通过结合番茄斑萎病毒核衣壳蛋白(TSWV NP)直接干扰相分离(PS)发生，抑制凝聚体而降低其致病性的机制。

　　番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)是一种三分体负义链RNA病毒,被认为是最具毁灭性的植物病毒之一。目前，用于防治TSWV的化学药剂可用抗病毒剂种类较少，且对不同病毒之间的防效差异较大。因此，发掘新型高效且作用机制独特的抗TSWV小分子对保障粮食安全具有重要意义。

　　相分离(PS)已成为各种病毒生命周期中的重要机制，在许多情况下，PS促进宿主细胞内无膜细胞器或生物分子聚集体的形成，这些细胞器可以作为病毒复制、转录和组装的枢纽。TSWV复制主要依赖于核糖核蛋白复合物(RNP)，其可以被认为是一种聚集体，它们的形成对于病毒的生命周期至关重要。因此，破坏RNP的形成或抑制TSWV复制并控制植物病害。鉴于RNPs的形成可能涉及TSWV NP的PS，如果能发现阻碍PS发生的抑制剂去干扰凝聚体RNP的形成，则有望控制TSWV在植物体内的增殖。目前在农业领域仍未见任何涉及小分子直接干扰PS发生并抑制凝聚体形成的报道。

图1 化合物29抑制TSWV增殖的可能作用机制模式图

　　作者通过简洁高效的5步取代反应合成了一系列香草醛衍生物，并通过半叶枯斑法测试了所有目标化合物的抗TSWV活性，其中，化合物29抗TSWV的钝化活性EC₅₀为154.8µg/mL，优于商品药剂利巴韦林ribavirin(701.9 µg/mL)，表明化合物29可能作为一种潜在的抗TSWV小分子。化合物29与TSWV NP的分子对接表明，TSWV NP^K68、TSWV NP^T92和TSWV NP^R94可能是化合物29作用于TSWV NP的潜在靶标位点。作者通过原核诱导表达纯化了野生型TSWV NP和突变型TSWV NP，通过生物膜层干涉分析测试了化合物29与两种蛋白的结合力，体外验证氨基酸位点作为潜在靶点的可能性。此外，通过同源重组法构建了突变的侵染性克隆TSWV^K68A、TSWV^T92A、TSWV^R94A、TSWV^K68AT92AR94A和TSWV^K68GT92GR94G，体内验证氨基酸位点作为潜在靶点的可能性。结果表明，单个氨基酸位点的突变对TSWV的侵染有一定的影响，但是只有三个氨基酸位点同时突变为丙氨酸(TSWV^K68AT92AR94A)时对TSWV的侵染影响更大。

　　以前的研究已经表明TSWV的侵染与寄主蛋白之间的密切联系，为了探索与TSWV NP相互作用的潜在寄主蛋白，作者采用了免疫沉淀与质谱联用，并通过Y2H、BiFC和LCA验证TSWV NP与寄主蛋白的互作，发现一种寄主蛋白GTP结合核蛋白(NbRANL)能够与TSWV NP相互作用(图2)。通过转录组学、瞬时过表达和Craspr-cas9基因敲除等验证表明NbRANL在TSWV的侵染中起着正向调控的作用。此外，作者还发现NP能够在体内通过相分离形成凝聚体(图3)，同时NbRANL能够促进TSWV NP凝聚体的形成。

图2 Y2H、BiFC和LCA验证TSWV NP和NP^K68AT92AR94A与NbRANL的相互作用。

图3 PS诱导NP凝聚体的形成

　　综上，该研究表明香草醛衍生物29通过结合TSWV NP的氨基酸位点，影响NP发生相分离形成凝聚体，同时发现寄主互作因子NbRANL能够促进NP形成凝聚体，为TSWV抗病毒药剂的发现及作用机制研究奠定了基础。此工作部分结果近期发表于Aggregate上(https://doi.org/10.1002/agt2.725)。贵州大学绿色农药全国重点实验室2019级农药学专业博士生王艳菊为论文第一作者，宋宝安、宋润江和俞露为该论文共同通讯作者。本研究得到国家自然科学基金(32330087，32302388)和科技攻关计划资助贵州省科研创新团队项目(2017-5788-1)和贵州大学科研创新团队项目(202403)的支持。